Enzim Katalase yang diproduksi oleh Bacillus subtilis berfungsi sebagai antioksidan dengan menguraikan hidrogen peroksida menjadi air dan oksigen, sehingga melindungi sel dari stres oksidatif. Penelitian ini bertujuan untuk memproduksi, memurnikan dan melakukan uji aktivitas enzim katalase yang dihasilkan oleh Bacillus subtilis dengan menambahkan inducer hati ayam. Penelitian ini menggunakan metode eksperimental yang dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Farmasi, dan Laboratorium Analisis Farmasi dengan menggunakan metode fermentasi cair untuk produksi enzim, pemurnian enzim menggunakan persentase kejenuhan ammonium sulfat, dan pengujian aktivitas enzim menggunakan spektrofotometri UV-Vis. Hasil produksi enzim katalase lebih banyak dengan menggunakan inducer hati ayam dibandingkan dengan tidak menggunakan inducer. Hasil pemurnian menggunakan ammonium sulfat menghasilkan beberapa fraksi yaitu 0-20%, 20-40%, 40-60%, dan 60-80%. Hasil uji kualitatif menunjukkan hasil positif katalase pada semua fraksi menghasilkan gelembung oksigen ketika direaksikan dengan H2O2. Serta uji aktvitas secara kuantitatif (Cell free supernatan, fraksi 0-20%, 20-40%, 40-60%, dan 60-80%) berturut-turut yaitu 0,855 U/mL, 0,676 U/mL, 1,139 U/mL, 3,704 U/mL, dan 4,089 U/mL. Berdasarkan hasil aktivitas enzim katalase tertinggi terdapat pada fraksi 60-80% sebesar 4,089 U/mL dan fraksi 0-20% menunjukan aktivitas terendah yaitu 0,676 U/mL. Kata Kunci: Enzim Katalase, Bacillus subtilis, Hidrogen Peroksida, Antioksidan