Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui Pengaruh Penambahan Air Kelapa pada Media Kultur In Vitro Tanaman Jeruk Nipis (Citrus aurantifolia). Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Maret-Oktober 2022 bertempat di Laboratorium Kultur Jaringan Fakultas Pertanian Jurusan Agroteknologi Universitas Negeri Gorontalo. Rancangan percobaan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan menggunakan empat taraf perlakuan yaitu kontrol (tanpa air kelapa), AK1 (120mL/L media), AK2 (160mL/L media), AK3 (200mL/L media). Setiap perlakuan diulang sebanyak empat kali sehingga diperoleh 16 unit percobaan. Variabel yang diamati adalah reaksi media eksplan, persen kontaminasi, jumlah daun, jumlah tunas, tinggi tunas, dan Panjang akar. Data dianalisis secara kuantitatif (menggunakan analisis sidik ragam) dan secara kualitatif (dilakukan secara deskriptif). Analisis data dilakukan dengan menggunakan sidik ragam ANOVA, yang mana jika f hitung lebih besar dari pada f tabel maka akan dilalukan uji terkecil BNT taraf 5%. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pemberian air kelapa sebagai zpt terhadap pertumbuhan tanaman jeruk nipis secara in vitro berpengaruh nyata terhadap tinggi tunas (4 MST), jumlah tunas (3 MST dan 4 MST), jumlah daun (3 MST dan 4 MST), Panjang akar (1, 2, 3, 4 MST). Kata kunci : in vitro, jeruk nipis,air kelapa